Nespecifický Biomonitoring Přítomnosti Toxických Látek Ve Vodě Pomocí Perlooček

nespecifický biomonitoring přítomnosti toxických látek ve vodě pomocí perlooček šárka veselá, vlastimil ondruška projekt obranného v

Nespecifický biomonitoring přítomnosti toxických látek ve vodě pomocí
perlooček
Šárka Veselá, Vlastimil Ondruška
Projekt obranného výzkumu „BIOMONITORING – Nespecifický biomonitoring
toxických látek a jedů v pitné vodě pro mírové a polní využití“ byl
řešen od roku 2003 do roku 2005 ve Výzkumném a vývojovém středisku
Hostivice (VVStř Hostivice). Předmětem řešení tohoto projektu bylo
prakticky ověřit možnost využití drobných vodních korýšů – perlooček
[16] pro nespecifický biomonitoring vody v polních podmínkách a
stanovit optimální druh, případně více druhů, které by bylo možné
použít jako biologickou součást zařízení pro průběžný nespecifický
biomonitoring vody v polních podmínkách, o jehož vývoji se do budoucna
uvažuje. Cílem výzkumu bylo zanalyzovat možnosti využití různých druhů
perlooček v závislosti na jednoduchosti jejich chovu a manipulace s
nimi, citlivosti k jednotlivým toxikantům reprezentujícím vybrané
skupiny látek, odezvy a snadnosti odečítání výsledků [14].
V průběhu řešení projektu bylo zakoupeno základní laboratorní vybavení
a provedeny rešeršní a studijní činnosti odborné literatury týkající
se tématu projektu. Aby mohly být provedeny plánované pokusy, bylo
nutno nejprve založit laboratorní chovy a vypracovat metodiku
dlouhodobého chovu perlooček a též metodiku přípravy krmiva.
Vzhledem k tomu, že existuje velké množství druhů perlooček [4] byl
proveden nejprve jejich teoretický předvýběr a poté byly shromážděny
vybrané druhy (Tab. č. 1). Ty byly většinou získány darem z již
zavedených laboratorních chovů. Pokud to bylo nutné, byla vyhledána
lokalita, kde se potřebné druhy vyskytovaly, a byl proveden jejich
odlov.
Při vývoji metodiky dlouhodobého laboratorního chovu byly provedeny
pokusy s cílem vybrat z výše uvedených druhů ty, které jsou
nejjednodušeji chovatelné (manipulace, náročnost na kultivační médium
a potravu, tolerance ke vlivům okolního prostředí, apod.) v podmínkách
s minimálním laboratorním vybavením [17]. Postup a výsledky těchto
pokusů jsou podrobně popsány ve článku „Výběr vhodných druhů a kmenů
drobných vodních korýšů pro využití v AČR“ [19]. S přihlédnutím k
možnému dalšímu využití perlooček jako testovacích organismů bylo
nutno otestovat možnosti chovu nezávisle na okolních zdrojích, tj.
především na chovném médiu získaném odběrem z vodních těles ve volné
přírodě. Proto byl proveden pokus, jehož cílem bylo ověřit možnost
využití média ISO [7] jako uměle připraveného chovného média pro
laboratorní chov perlooček. Tento experiment je podrobně popsán v
článku „Laboratorně připravené médium pro chov perlooček“ [18]. Na
základě vyhodnocení výsledků s chovy jednotlivých druhů perlooček,
zanalyzování aktuálních možností a požadavků, bylo množství druhů a
klonů pro další pokusy zúženo na čtyři: PU3 (druh Daphnia pulicaria),
TG100 (druh Daphnia galeata), PXCL (druh Daphnia pulex), VSCHT (druh
Daphnia magna), které mohou být dle aktuální situace a potřeby dále
doplněny.
Název
klonu
Druh
V laboratoři chován od r.
Původ
Druh potvrzen genetickou analýzou
TG100
Daphnia galeata
21. 7. 1992
jezero Tijeukemeer, Nizozemí [12]
Ano
TC33
Daphnia cucullata
28. 10. 1992
jezero Tijeukemeer, Nizozemí [12]
Ano
CL2
Daphnia cucullata
Datum narození matky 16. 8. 1997
laboratorní křížení, NIOO-Cl1,Nizozemí
Ano
DL3
Daphnia lumholtzi
3. 2003
Thajsko
neprovedeno
PU3
Daphnia pulicaria
Nizozemí
neprovedeno
SP2
Daphnia pulicaria
23. 11. 1998
Blomsterstrand, Špicberky
Ano
PXCL
Daphnia pulex
13. 8. 1998
jezírkoVijver, Nizozemí
Ano
P
Daphnia magna
29. 9. 2003
Prosek, Praha, ČR
neprovedeno
VSCHT
Daphnia magna
1996
VŠCHT, ÚCHOP2, ČR
HK
Daphnia magna
Firma EMPLA, ČR (klon a sensu
Baird et al [1]
CERIO
Ceriodaphnia sp.
2. 7. 2003
Hostivice, ČR
neprovedeno
Tab. č. 1 Druhy a klony perlooček získané pro laboratorní chov a
používané v pokusech uvedených v této práci
Souběžně s experimenty s chovy perlooček probíhal vývoj aparatury pro
kultivaci řas, jednalo se o druh Scenedesmus acutus. Tato řasa byla
používána jako potrava pro perloočky. Vývoj aparatury spolu s nákresy
jsou popsány v článku „Vývoj kultivační aparatury pro kultivaci řas v
AČR“ [20]. Bylo vybráno vhodné kultivační médium a testován
nejoptimálnější způsob jeho přípravy, což je popsáno v článku
„Modifikace přípravy zásobních roztoků média BB a jejich vliv na růst
řasové kultury“ [21].
Možnost chovu vybraných druhů perlooček a dlouhodobá kultivace řas
byly též úspěšně testovány v podmínkách modelového kontejnerového
pracoviště, které má VVStř Hostivice k dispozici.
Hlavním cílem projektu bylo zjistit citlivosti perlooček k toxikantům
reprezentujícím vybrané skupiny látek. Pro provedení těchto pokusů
byla využita metodika ekotoxikologických testů, jež je popsaná v normě
ČSN EN ISO 6341 Jakost vod – Zkouška inhibice pohyblivosti Daphnia
magna Straus (Cladocera, Crustacea) – Zkouška akutní toxicity [7].
Ekotoxikologické testy jsou běžným nástrojem používaným v akvatické
ekotoxikologii, kde slouží především k charakterizaci rizika, jež
testované látky nebo jejich směsi představují pro vodní ekosystémy a
zároveň popisují, jak se jejich působení může projevit a jaký bude
jejich osud. Principem testů je stanovení procentuálního počtu jedinců
u kterých se po uplynutí zvolené doby projeví sledovaný efekt (např.
úmrtí, nehybnost) a to vše při několika koncentracích testované látky.
Cílem testů je určit tzv. hodnotu „efektivní koncentrace – EC50“. Je
to počáteční hodnota koncentrace testované látky v médiu, při které se
sledovaný efekt projeví u 50% organismů použitých v daném testu [11].
Efektem zvoleným pro pokusy byla imobilizace zvířat. Jako
imobilizované jsou považovány všechny perloočky, které se jako
výsledek toxického působení testované látky nejsou schopny rozplavat
během 15 vteřin po mírném zamíchání roztoku v kádince.
Při řešení projektu byla tato metodika využita jako základní nástroj
pro zjištění citlivosti perlooček vůči vybraným látkám. Zároveň se
stanovováním hodnot EC50 probíhalo i vizuální sledování chování
perlooček v jednotlivých koncentracích a při působení testovaných
látek. Pro testování byly zvoleny dvě skupiny látek – ireversibilní
inhibitor acetylcholinesterázy (vybraná byla látka tabun) a
reaktivátory acetylcholinesterázy (oximy). V rámci skupiny
reaktivátory acetylcholinesterázy bylo použito více látek, aby byla
otestována citlivost perlooček vůči látkám majícím podobný mechanismus
účinku, ale odlišnou chemickou strukturu.
Tabun (GA, O-ethyl-N,N-dimethylamidokyanofosfát) je první uměle
vytvořená nervově paralytická bojová otravná látka (1936, IG Farben,
Německo) [13]. Hlavní toxický efekt je u savců způsoben jejich
interakcí s enzymem acetylcholinesterázou (AChE, EC 3.1.1.7),
ireversibilní fosorylací jeho aktivního místa a následnou inhibicí. To
způsobí akumulaci acetylcholinu na synapsích v periferním i centrálním
cholinergním nervovém systému a na nervosvalovém spojení, což vede k
rozvrácení jejich normální funkce [2,3]. Při biochemickém rozboru
homogenátů získaných z těl perlooček rodu Daphnia magna bylo zjištěno,
že perloočky mají cholinergní nervový systém [8,9]. Jak bylo
předpokládáno, tabun byl pro perloočky velmi toxický i při krátké
expoziční době a jeho toxicita se s časem zvyšovala. Zjištěná akutní
toxicita tabunu vyjádřená hodnotou EC50 (doba expozice byla od 15 do
60 minut) pro Daphnia magna byla v rozmezí 85,03 μg.l-1 (při expozici
15 minut) do 21,90 μg.l-1 (při expozici 60 minut) [22].
Sloučeniny typu oximů (testovány byly: pralidoxim, trimedoxim,
obidoxim, HI-6, K027, K033 a K048) se používají pro reaktivaci
organofosfáty inhibované acetylcholineasterázy. Mechanismus jejich
účinku spočívá v obnovení normálního přenosu cholinergního nervového
vzruchu reaktivací inhibované AChE a to odtržením inhibitoru
(organofosfát) navázaného na specifické vazebné místo AChE a
vytvořením komplexu oxim - organofosfát [2]. Na základě získaných
výsledků jsou oximy toxické pro juvenilní jedince perloočky Daphnia
magna již při poměrně nízké koncentraci (jedná se o miligramy na litr
média u pralidoximu a desítky respektive stovky miligramů na litr u
ostatních testovaných oximů). Při sledování toxicity v čase bylo
zjištěno, že stoupá s dobou expozice [23].
Jak bylo zjištěno, perloočky jsou velice citlivé na přítomnost
toxikantů v médiu. Různé změny v chování byly pozorovány v závislosti
na typu použité látky, její toxicitě a formě toxického účinku. Při
testování akutní toxicity nervově paralytické látky tabun bylo možno
vizuálně pozorovat změnu v charakteru a směru plavání perlooček
přibližně po pěti minutách, u oximů byly pozorovány změny v chování po
několika hodinách.
Perloočky jsou oblíbení a často používaní živočichové v normativních
testech v oblasti akvatické ekotoxikologie. Nejčastěji se pracuje s
„velmi velkým“ druhem Daphnia magna, mimo něj se občas používají dva
„velké druhy“ perlooček, Daphnia pulicaria a Daphnia pulex [6].
Přestože existuje mnoho dalších druhů [4], tyto se v
ekotoxikologických testech neužívají.
Nejčastějšími důvody pro zvolení druhu D. magna jsou jeho velikost a
relativně největší množství neonát v jedné snůšce v porovnání s
ostatními druhy [5]. Přesto, že zvířata určená pro laboratorní testy
jsou většinou chovaná za standardizovaných podmínek, přirozený habitat
a „life-history“ strategie se mohou u různých druhů perlooček
odlišovat [10].
V dalším experimentu bylo proto cílem otestovat citlivost čtyř již
dříve vybraných odlišně velkých druhů perlooček vůči modelovému
toxikantu (zinku). Jak bylo očekáváno, toxicita zinku klesala se
vzrůstající velikostí testovaných druhů. Nejmenší druh Daphnia galeata
(hodnota EC50 při 24 hodinové expozici byla 999 μg.l-1) byl vůči zinku
nejcitlivější a největší druh Daphnia magna nejméně citlivý (hodnota
EC50 při 24 hodinové expozici byla 4461 μg.l-1). Při dalších testech
je proto nutné vzít v úvahu možné rozdíly v citlivosti odlišných druhů
perlooček a v ideálním případě provádět výzkum současně na nejméně a
nejvíce citlivém druhu.
Je možno shrnout, že perloočky jsou organismy, které lze s úspěchem
využít pro detekci toxického znečištění vody, a to i při znečištění
neznámým toxikantem (nebo jejich směsí), či při znečištění toxickými
produkty jejich rozkladu. Po dopracování metodik sledování a
vyhodnocení je možné je využít jako biologickou součást zařízení pro
průběžný nespecifický biomonitoring vody v polních podmínkách.
Vzhledem k úspěchům projektu BIOMONITORING se počítá s jeho
pokračováním. Záměrem výzkumu tentokrát bude porovnat reakce perlooček
na působení vybraných potenciálně zneužitelných toxických látek
odlišného toxického účinku pomocí snímání a analýzy pohybu perlooček.
Na základě získaných poznatků bude možno již přistoupit k vývoji
zařízení pro průběžný nespecifický biomonitoring vody.
Literatura:
1.
Baird, D.J. - Barber, I. - Bradley, M. - Calow, P. - Soares,
A.M.V.M. 1989. The Daphnia bioassay: a critique. Hydrobiologia
188/189, p. 403 – 406.
2.
Bajgar, J., 2004a. Organophosphates nerve agents poisoning:
mechanism of action, diagnosis, prophylaxis and treatment. Adv.
Clin. Chem., 38, p. 151 - 216.
3.
Bajgar, J., 2004b. Nervově paralytické látky. In Patočka, J.
(ed.), Vojenská toxikologie. Grada Publishing, Praha, p. 30 – 44.
4.
Benzie, J.A.H., 2005. Cladocera: The genus Daphnia (including
Daphniopsis). Guides to the identification of the
microinvertebrates of the continental waters of the world vol. 21.
Kenobi Productions, Ghent, Belgium.
5.
Canton, J.H. - Adema, D.M.M., 1978. Reproducibility of short-term
and reproduction toxicity experiments with Daphnia magna and
comparison of the sensitivity of Daphnia magna with Daphnia pulex
and Daphnia cucullata in short term experiments. Hydrobiologia,
59, p. 135 - 140.
6.
Cooney, J.D., 2003. Freshwater tests. In Rand GM. (ed.),
Fundamentals of aquatic toxicology. Tailor & Francis, New York, p.
71 - 102.
7.
ČSN EN ISO 6341, 1997, 1999, 2000. Jakost vod – Zkouška inhibice
pohyblivosti Daphnia magna Straus (Cladocera, Crustacea) – Zkouška
akutní toxicity. Oprava 1, oprava 2, ČNI, Praha.
8.
Diamantino, T.C. - Almeida, E., - Soares, A.M.V.M. - Guilhermino,
L., 2003. Characterization of cholinesterases from Daphnia magna
Straus and their inhibition by zinc. Bull. Environ. Contam.
Toxicol., 71, p. 219 - 225.
9.
Guilhermino, L. - Lopes, M.C. - Carvalho, P. - Soares, A.M.V.M.,
1996. Acetylcholinesterase activity in juveniles of Daphnia magna
Straus. Bull. Environ. Contam. Toxicol., 57, p. 979 -985.
10.
Koivisto, S., 1995. Is Daphnia magna an ecologically
representative zooplankton species in toxicity tests? Environ.
Pollut., 90, p. 263 - 267.
11.
Newman, C., 1995. Quantitative methods in aquatic toxicology.
Lewis Publishers, Florida.
12.
Repka, S. - Veselá, š. - Weber, A. - Schwenk, K., 1999. Plasticity
in filtering screens of Daphnia cucullata x galeata hybrids and
parental species at two food concentrations. Oecologia, 120, p.
485 - 491.
13.
Reutter, S., 1999. Hazards of chemical weapons release during war:
New perspectives. Environ. Health. Perspect., 107, p. 985 – 990.
14.
Veselá, Š., 2003a. Využití drobných vodních korýšů pro detekování
toxického znečištění vody. Zprav. voj. farmac., 13 (4), s. 18 –
23.
15.
Veselá, Š., 2003b. Jak se „dělá věda“ v zahraničí. Zprav. voj.
farmac., 13 (3), s. 13 – 17.
16.
Veselá, Š., 2004a. Co víme (a nevíme) o perloočkách. Perloočky v
ekotoxikologii. In Kočí, V., Halousková, O., eds.,
Ekotoxikologické biotesty IV, 15.-17. září 2004, Chrudim, Vodní
zdroje Ekomonitor, s. 18 - 25.
17.
Veselá, Š., 2004b. Jak úspěšně chovat perloočky. In Kočí, V.,
Halousková, O., eds., Ekotoxikologické biotesty IV, 15.-17. září
2004, Chrudim, Vodní zdroje Ekomonitor, s. 30 -39.
18.
Veselá, Š., 2004c. Laboratorně připravené médium pro chov
perlooček v AČR. Zprav. voj. farmac., 14 (2), s. 12 - 16.
19.
Veselá, Š., 2004d. Výběr vhodných druhů a kmenů drobných vodních
korýšů pro využití v AČR. Zprav. voj. farmac., 14 (4), s. 14 – 19.
20.
Veselá, Š. - Ondruška, V., 2004. Vývoj kultivační aparatury pro
kultivaci řas v AČR. Zprav. voj. farmac., 14 (3), s. 26 - 30.
21.
Veselá, Š. - Táborská, K. - Ondruška, V., 2005a. Modifikace
přípravy zásobních roztoků média BB a její vliv na růst řasové
kultury. Zprav. voj. farmac., 15 (1), s. 3 - 7.
22.
Veselá, š. - Kuča, K. - Jun, D. 2005b. Sensitivity of Daphnia
magna Straus to tabun and its degradation products. Task Group on
Prophylaxis and Therapy Against Chemical Agents (TG-004) Meeting,
23 – 26 May 2005, Hradec Králové, Collection of abstracts, p. 70.
23.
Veselá, š. - Kuča, K. - Jun, D. - Patočka, J. 2005c. Might
Daphnids be new experiemntal animals in military toxicology? Task
Group on Prophylaxis and Therapy Against Chemical Agents(TG-004)
Meeting, 23 – 26 May 2005, Hradec Králové, Fulltext Proceeding.
1 NIOO-CL = Nizozemský ústav pro ekologii – Limnologický ústav,
součást Královské nizozemské akademie věd [15]
2 VŠCHT= Vysoká škola chemicko-technologická, Ústav chemie ochrany
prostředí