CURSO 2002/03 CENTRO FAC CC EXPERIMENTALES ESTUDIOS LICENCIADO

______________________________________________________________________ curso: 2002/03 centro: fac. cc. experimentales estudios: licenc

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CURSO: 2002/03
CENTRO: FAC. CC. EXPERIMENTALES
ESTUDIOS: LICENCIADO EN QUÍMICAS-1994
ASIGNATURA: EXPERIMENTACION EN QUIMICA FISICA
CÓDIGO: 530404
CICLO: 2º
CURSO: 4º
CUATRIMESTRE: 2º
CARÁCTER: TRONCAL
CRÉD. TEÓ.: 0,00
CRÉD. PRÁC.: 3,50
ÁREA: QUIMICA FISICA
DEPARTAMENTO: QUIMICA FISICA, BIOQUIMICA Y QUIMICA INORGANICA
DESCRIPTORES: LABORATORIO INTEGRADO DE APLICACIÓN DE TÉCNICAS
INSTRUMENTALES PARA LA RESOLUCIÓN DE PROBLEMAS ANALÍTICOS Y SINTÉTICOS
CONCRETOS. APLICACIÓN AL ESTUDIO DE PROBLEMAS CLÍNICOS.
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TEMARIO DE PRÁCTICAS.
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Práctica 1. Determinación de la masa molecular de proteínas mediante
cromatografía líquida deexclusión molecular.
Para el desarrollo de la práctica se utiliza una columna de exclusión
molecular (Sephacryl S-300). Una vez equilibrada la columna en tampón
Hepes 50 mM. NaCl 0,1 M y pH 7, se cromatografía una muestra patrón
con diversas proteínas de masas moleculares conocidas. Se construye la
recta de calibrado utilizando la relación semiempírica entre el
volumen de elución y la masa molecular. Posteriormente se
cromatografía una proteína problema y se determina su volumen de
elución, mediante la recta patrón se calcula su masa molecular.
La realización de la práctica se divide en tres sesiones:
1ª Sesión. (3 horas): Preparación de las disoluciones tampón y de las
muestras de proteína.
2ª Sesión. (3 horas): Equilibrado de la columna de exclusión
molecular, cromatografía de las muestras patrón y a continuación de la
proteína problema.
3º Sesión (3 horas): Cálculos y análisis de los resultados.
Práctica 2. Calorimetría isotérmica de valoración para la
determinación de las magnitudes termodinámicas de la unión de
3’detoxicitidín monofosfato a la proteína Ribonucleasa A.
El objetivo de esta práctica es introducir al estudiante en la técnica
de Calorimetría Isotérmica de Valoración, la más útil para la
obtención directa de constantes de unión y parámetros termodinámicos
de las reacciones.
1ª Sesión. (3 horas): Introducción teórica de la técnica
calorimétrica. Preparación de las disoluciones tampón y de las
muestras de proteína.
2ª Sesión. (3 horas): Valoración calorimétrica de la proteína con
3’dCMP. Cada grupo realizará la valoración en distintas condiciones de
pH y fuerza iónica.
3º Sesión (3 horas): Obtención de parámetros termodinámicos.
Práctica 3. Determinación de.las constantes de unión de succinato y
cloruro a la enzima glutamato oxalacetato transaminasa
El objeto de esta práctica es la determinación de las constantes de
unión de succinato y cloruro a la GOT, para lo cual se sigue con un
método espectrofotométrico
1ª Sesión. (2 horas): Preparación de las muestras y disoluciones
tampón
2ª Sesión. (3 horas): Realización de las medidas espectrofotométricas
3º Sesión (3 horas): Cristalización de la proteína mediante varias
técnicas de cristalización de proteinas de uso común.
Práctica 4. Determinación de la constante de unión de un ligando a una
macromolécula mediante espectrofluorimetría.
El objeto de esta práctica es la determinación de las constantes del
equilibrio de asociación del ligando a una macromolécula. Se utiliza
la técnica espectrofluorimétrica para seguir la reacción de unión del
ligando a la macromolécula
1ª Sesión (3 horas): Preparación de disoluciones y de la muestra.
2ª Sesión (3 horas): Determinación del espectro de fluorescencia de la
macromolécula en presencia de diferentes concentraciones de ligando
para determinar la cantidad de ligando unido.
3º Sesión (3 horas): Análisis de los datos de unión del ligando a la
macromolécula para obtener la constante de equilibrio.
BIBLIOGRAFÍA.
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*
Cantor, C. R. Y Schimell, P. R. (1980) “Biophysical Chemistry”
Freeman, San Francisco, 3 volúmenes
*
Edsall, J. T. Y Gutfreund, H. (1983) “Bio-thermodynamics. The
study of Biochemical Processes at Equilibrium”, Jon Wiley and
Sons, Chichester, Nueva York
*
Kenney, A. Y Fowell, S. Ed. (1992) “Methods in Molecular Biology”
vol. 11 “Practical Protein Chromatography”, Humana Press, Totowa,
Nueva Jersey.
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Van Holde, R. E. (1985) “Physical Biochemistry” 2ª ed., Prentice
Hall, Englewood Cliffs.
*
Wyman, J. Y Gill., S. J. (1990) “Binding and Linkage: Functional
Chemistry of Biological Macromolecules”University Science Books
Mill Valley.
CRITERIOS DE EVALUACIÓN.
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Examen teórico sobre los fundamentos y metodología de las prácticas.
Cuaderno de prácticas donde se detallen todos los cálculos, resultados
experimentales, análisis de datos e interpretación de de los
resultados obtenidos. La nota se calcula dándole un 60% al examen
teórico y un 40% al cuaderno.