comparación entre enzimoinmunoensayo e inmunofluorescencia indirecta para deteccion de anticuerpos anticentromero boglione, l1; ferrero, p

COMPARACIÓN ENTRE ENZIMOINMUNOENSAYO E INMUNOFLUORESCENCIA INDIRECTA
PARA DETECCION DE ANTICUERPOS ANTICENTROMERO
Boglione, L1; Ferrero, P1; Mussano, E2; Onetti, L2; Acosta, C1.
1 Laboratorio de Inmunología y Virología, Hospital Nacional de
Clínicas, Facultad de Ciencias Médicas, Universidad Nacional de
Córdoba
2 Servicio de Reumatología, Unidad Hospitalaria de Medicina Interna I,
Hospital Nacional de Clínicas, Facultad de Ciencias Médicas,
Universidad Nacional de Córdoba
Laboratorio de Inmunología y Virología, Hospital Nacional de Clínicas,
Facultad de Ciencias Médicas, Universidad Nacional de Córdoba.
Santa Rosa 1564- Córdoba- Argentina
[email protected]
03525-15534755
RESUMEN
INTRODUCCIÓN: Los anticuerpos anti-centrómero (ACAs) son detectados
por inmunofluorescencia indirecta (IFI) sobre células Hep-2. Los
enzimoinmunoensayos (ELISAs) detectan anticuerpos reactivos contra las
distintas subunidades del centrómero (CENP) como CENP-A y CENP-B.
OBJETIVO: Calcular sensibilidad y especificidad del ELISA anti-CENP-A
y CENP-B (anti-CENPA/B) en relación a la IFI y el índice de
concordancia entre ambos métodos.
MATERIALES Y MÉTODOS. Se seleccionaron 81 muestras de suero de
pacientes que acudieron al Laboratorio de Inmunología con solicitud
médica de anticuerpos antinucleares (ANA): 55 de ellos con resultado
positivo por IFI y 26 negativo. En los 81 sueros se realizó la
determinación de ACAs por ELISA anti-CENP-A /B.
RESULTADOS: De 28 muestras con ACAs positivos por IFI, 2 resultaron
negativas por ELISA, mientras que de 53 muestras con ACAs negativos
por IFI, 2 fueron positivas por ELISA. La sensibilidad y la
especificidad del ELISA resultaron 92,8% (IC 95%=76,46%-98,9%) y 96,2%
(IC 95%= 87,0-99,4), respectivamente y el índice kappa= 0,89 (IC
95%=0,79-0,99). En 25 muestras positivas para ANA con patrones no
anti-centrómero y en 26 muestras con ANAs negativos, los anticuerpos
anti-CENP-A/B resultaron negativos.
CONCLUSION: ELISA anti-CENPA/B muestra un buena concordancia con IFI
en la detección de ACAs. Los valores de sensibilidad y especificidad
respecto de la IFI son relativamente altos (> 90%).
Palabras clave: centrómero, inmunofluorescencia indirecta,
enzimoinmunoensayo, cel-Hep-2.
INTRODUCCION
Las enfermedades autoinmunes del tejido conectivo dan lugar a una
variedad de signos y síntomas, que muchas veces se superponen entre
una patología y otra. La detección de auto anticuerpos constituye una
herramienta fundamental para el diagnóstico certero. Este hecho motiva
a los profesionales de laboratorio a conocer y mejorar la eficiencia
de las pruebas utilizadas para tal fin. La técnica más usada en el
tamizaje de anticuerpos anti-nucleares (ANAs) es la
Inmunofluorescencia Indirecta (IFI) que tiene como sustrato antigénico
una línea celular de carcinoma laríngeo humano (células HEp-2) (1,2).
Salvo pocas excepciones, como es el caso de los anticuerpos
anti-centrómero (ACAs), el resultado positivo de esta prueba indica la
presencia de ANAs pero no identifica la especificidad antigénica de
los mismos (3). Por ello, es necesario emplear técnicas adicionales
como Inmunoprecipitación (IP), Inmunoblotting (IB), enzimoimnunoensayo
(ELISA) o ensayo inmunoblot lineal (LIA) (4,5). La disponibilidad de
diferentes métodos y marcas comerciales en el mercado para la
identificación de ANAs es muy amplia, sin embargo éstos carecen de
estandarización adecuada, por lo que en ocasiones, se observan
diferencias significativas en cuanto a la sensibilidad y la
especificidad entre estos métodos (6).
Ha sido demostrado reiteradamente el rol de los ACAs como
biomarcadores en el diagnóstico de la Esclerosis Sistémica (ES), ya
que están presentes en 20 a 40% de estos pacientes asociados con la
forma cutánea limitada de la enfermedad conocida como Síndrome CREST
(calcinosis, fenómeno de Raynaud, dismotilidad esofágica,
esclerodactilia y telangiectasia) (7). Si bien los ACAs son
relativamente específicos para ES, han sido detectados, generalmente a
bajos títulos, en otras condiciones autoinmunes como Lupus Eritematoso
Sistémico (LES), Cirrosis Biliar Primaria (CBP), Artritis Reumatoidea
(AR), Síndrome de Sjögren (SSj), como también en sujetos sin
enfermedad aparente del tejido conectivo (8,9).
Desde su descripción, los ACAs han sido detectados por IFI utilizando
como sustrato las líneas mencionadas (HEp-2) que permiten identificar
el patrón nuclear particular de estos anticuerpos (10).
El centrómero está formado por distintas subunidades proteicas, dentro
de las cuales CENP-A, CENP-B y CENP-C fueron identificadas
tempranamente como blancos de los ACAs (11). Un estudio reciente
demostró que ACAs de suero de pacientes con ES reconocen al menos 11
subunidades CENP diferentes (12). A partir del aislamiento y la
clonación de algunas de ellas han surgido nuevos métodos de
laboratorio como ELISAs que emplean la proteína de fusión CENP-B (13).
Estos equipos comerciales reportan una sensibilidad que oscila
alrededor de 94-95% comparados con IFI sobre células HEp-2 (13-15).
Algunos estudios demuestran que los ELISAs que incorporan ambas
proteínas, CENP-A y CENP-B, poseen mayor sensibilidad que los que
emplean sólo una de ellas (16-18).
El objetivo de este trabajo fue calcular la sensibilidad y la
especificidad de un ELISA para la detección simultánea de anticuerpos
anti-CENP-A y anti-CENP-B utilizando como técnica de referencia la IFI
y la concordancia entre ambos métodos.
MATERIALES Y METODOS
MUESTRAS
Se seleccionaron 81 muestras de suero de pacientes provenientes de
distintos servicios médicos del Hospital Nacional de Clínicas que
acudieron al Laboratorio de Inmunología con solicitud de ANAs: 26
sueros con resultados negativos para ANAs por IFI sobre Hep-2 y 55
sueros con ANAs positivos cuya distribución de patrones de
fluorescencia fue la siguiente: 28 sueros con figura anti-centrómero,
11 nucleolar y 16 moteada. Posteriormente, los 81 sueros fueron
estudiados con una técnica de ELISA que detecta simultáneamente los
anticuerpos anti-CENP-A y anti-CENP-B (CENP-A/B).
ENSAYO DE INMUNOABSORCIÓN LIGADO A ENZIMA (ELISA)
La determinación de anticuerpos anticentrómero por ELISA se realizó
con un equipo comercial a base de antígenos recombinantes CENP-A y
CENP-B (QUANTA Lite TM Centromere, INOVA Diagnostics, San Diego,
EEUU). Las muestras fueron procesadas siguiendo las instrucciones del
fabricante. Brevemente, se incubaron en los pocillos los sueros
diluidos, y duplicados de los siguientes controles de ACAs provistos
por el fabricante: positivo fuerte, positivo débil y negativo. Al
término de la incubación se procedió a una serie de lavados y al
agregado de anti-IgG marcado con peroxidasa a cada pocillo. Luego de
la segunda serie de lavados, se añadió el sustrato 3’3’5’5’
tetrametilbencidina (TMB) en presencia de peróxido de hidrógeno para
proceder a la última incubación. Al término de la misma, se detuvo la
reacción con ácido y se leyó a 450 nm en lector de microplacas Sirio S
(SEAC, RADIM, Roma, Italia). La reactividad de las muestras está
relacionada de manera no lineal con la cantidad de anticuerpo
presente. La reactividad (Unidades) se calculó como la razón entre el
valor de DO (densidad óptica) de cada muestra y el valor promedio de
DO del control positivo débil, multiplicado por el valor de
concentración (Unidades) del control positivo débil. Los resultados de
la prueba se interpretaron de la siguiente manera: menor a 20
Unidades= Negativo; entre 20 y 30 Unidades=Débil Positivo; mayor a 30
Unidades= Positivo.
INMUNOFLUORESCENCIA INDIRECTA
La IFI se realizó en improntas de células HEp-2 (Bion, España), con
dilución fija del suero 1:40 (en los casos de ANA positivos, no
anticentrómero se realizaron diluciones hasta título final para
descartar posibles ACA ocultos bajo el patrón predominante); como
buffer de dilución y lavado se usó PBS y como conjugado una
antigamaglobulina anti-IgG marcada con Isotiocianato de fluoresceína
(FITC) (Biocientífica, España), en dilución 1:100. La observación se
realizó en un microscopio de fluorescencia Olympus (Japón).
ANÁLISIS ESTADÍSTICO
Para el cálculo de sensibilidad y especificidad del ELISA
anti-CENP-A/B relativas a IFI y el índice de concordancia kappa (k) se
usó el programa estadístico MedCalc.
RESULTADOS
La Tabla 1 muestra la distribución proporcional de resultados
categóricos para ACAs obtenidos por ambas técnicas, ELISA e IFI, en
las 81 muestras de suero analizadas. La sensibilidad calculada del
ELISA CENP-A/B fue de 92,8 % (IC 95%=76,46%-98,9%) y la especificidad
de 96,2 % (IC 95%= 87,0-99,4); y el índice kappa = 0,89 (IC
95%=0,79-0,99). En 25 muestras con patrones de ANAs no
anti-centrómero, y en 26 muestras ANAs negativo, los anti-CENP-A/B
resultaron negativos. De 28 muestras con ACAs positivas por IFI, 2
resultaron negativas por ELISA, mientras que de 53 muestras con ACAs
negativos en IFI, 2 fueron positivas por ELISA. Estas dos últimas
mostraron un patrón de fluorescencia moteado a títulos altos y no fue
posible detectar ACAs aún a altas diluciones del suero.
DISCUSIÓN
Tradicionalmente los ACAs han sido detectados por IFI sobre células
HEp-2. Es conocida la propiedad de esta línea de presentar células en
distintos estadios de división que hace posible identificar el patrón
nuclear característico de estos autoanticuerpos, sin necesidad de
recurrir a otras técnicas para confirmar su especificidad. Sin
embargo, la identificación y clonación de nuevas subunidades del
centrómero ha promovido el desarrollo de métodos que las incorporan
como base antigénica, por ejemplo: ELISA e IB. Entre los métodos de
detección de ACAs han surgido varios equipos de ELISA que incorporan
subunidades CENP como base antigénica, tanto de manera individual como
combinada, y dentro de ellos, los más difundidos son los que emplean
CENP-B y CENP-A (16-18).
Cabe señalar que una de la últimas guías para el uso de pruebas
inmunológicas realizadas por expertos, no presenta evidencias a favor
del empleo de otras técnicas para el tamizaje de ACAs en lugar de IFI
en HEp-2 (19,20).
En el presente trabajo, se valoraron los parámetros analíticos:
sensibilidad, especificidad de un ELISA comercial para la detección
simultánea de anticuerpos anti-CENP-A y CENP-B en relación a la IFI en
HEp-2, que es la técnica de referencia para la detección de ACAs, y se
calculó, además, la concordancia entre ambos métodos.
Los valores de sensibilidad y especificidad que se obtuvieron para
ELISA anti-CENP-A/B son algo inferior a los reportados por el
fabricante (100% de sensibilidad y 98% de especificidad). Por otra
parte, la concordancia entre ambos métodos es buena. En este estudio
no se obtuvieron datos clínicos de los pacientes, por lo que no es
posible concluir a cerca de la conveniencia de reemplazar a la técnica
de referencia por el ELISA anti-CENPA/B.
Inclusive, debe tenerse en cuenta que el uso de IFI como prueba de
pesquisa de auto anticuerpos permite detectar otros ANAs que pudieran
estar presentes en lugar de ACAs (21).
En este estudio se obtuvieron resultados positivos por ELISA
anti-CENPA/B en dos muestras en las que se observó un patrón fuerte
moteado en la IFI. En esta situación, se podría especular que la
presencia de otros ANAs interfiere con la visualización del patrón
anticentrómero, aún a dilución final del suero, por lo que el uso
conjunto de ELISA e IFI podría aumentar la sensibilidad en la
detección de ACAs. Por otra parte, se debe considerar que podría
tratarse de resultados falsos positivos del ELISA en ambas muestras
ACAs negativa (ANAs positivos) por IFI.
En cuanto a las dos muestras con ACAs positivo por IFI que resultaron
negativas por ELISA anti-CENPA/B, es posible que el patrón observado
en ambas se deba a la reactividad de los ACAs contra otras subunidades
CENP, que no son A y B. Estudios recientes demuestran que sueros de
pacientes con ES poseen ACAs que reconocen diferentes subunidades del
centrómero y que, a su vez, los distintos perfiles de anti-CENP
encontrados en los pacientes se relacionan con manifestaciones
clínicas particulares de la misma enfermedad (12).
CONCLUSIÓN
ELISA anti-CENPA/B muestra un buena concordancia con IFI en la
detección de ACAs. Los valores de sensibilidad y especificidad
relativos a la IFI son relativamente altos, sin embargo, es necesario
estudiar sensibilidad y especificidad diagnóstica del ELISA
anti-CENPA/B para evaluar la posibilidad de emplearlo como método de
pesquisa de ACAs en lugar de IFI.
TABLAS
Tabla 1: Comparación de los resultados entre ELISA e IFI para la
determinación de ACA en los 81 sueros.
ACA IFI(+)
ACA IFI(-)
TOTAL
ACA ELISA (+)
26 (VP)*
2 (FP)€
28
ACA ELISA (-)
2 (FN)&
51(VN)£
53
TOTAL
28
53
81
*VP: Verdaderos Positivos.
£VN: Verdaderos Negativos.
€FP: Falsos Positivos.
&FN: Falsos Negativos.
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