PLANTAS CON ACTIVIDAD ALELOPÁTICA FUENTE DE HERBICIDAS NATURALES R

plantas con actividad alelopática: fuente de herbicidas naturales r. garcía-mateosab, r. pérez-lealb, m. soto-hernándezc, c. peña valdiviac

PLANTAS CON ACTIVIDAD ALELOPÁTICA: FUENTE DE HERBICIDAS NATURALES
R. García-Mateosab, R. Pérez-Lealb, M. Soto-Hernándezc, C. Peña
Valdiviac
aÁrea de Química, Preparatoria Agrícola, Universidad Autónoma
Chapingo, Chapingo, México, 56230, [email protected]
bPosgrado de Horticultura, Departamento de Fitotecnia. Universidad
Autónoma Chapingo, Carr. Méx. –Tex. km 38.5, Chapingo, México,
56230Chapingo. Méx. C.P. 56230.
c Colegio de Postgraduados, Carr. Méx. –Tex. km 35.5, Montecillo,
México, 56230. [email protected]
RESUMEN
El desarrollo de malas hierbas afecta el rendimiento de cultivos. El
uso de herbicidas sintéticos para su control ha ocasionado daños a la
salud humana. Esto ha intensificado la búsqueda de compuestos
biodegradables con actividad herbicida. Sustancias con actividad
alelopática son sintetizadas por vegetales como parte de su mecanismos
de defensa, como plantas de la misma especie que compiten por su
existencia. El estudio de los efectos de algunas especies en el
porcentaje de germinación y daños en el desarrollo normal de arvenses
ha permitido detectar la actividad alelopática de algunas plantas.
Estos resultados permitirán identificar nuevas sustancias con
actividad herbicida.
1.INTRODUCCIÓN
Se han utilizado cientos de químicos nocivos para la elaboración de
agroquímicos, sin embargo, el uso de estos compuestos sintéticos han
causado serios daños al ambiente y a la salud humana, la mayoría
irreversibles al ambiente; estos daños se deben a la naturaleza no
biodegradable y sintética de muchos agroquímicos. Las plantas
sintetizan diferentes metabolitos que semejan la acción de los
químicos sintéticos con la ventaja de que son biodegradables, claro
ejemplo de esto son los aleloquímicos, productos que por su naturaleza
orgánica, se consideran saludables para el consumidor y el ambiente1.
El estudio de esas interacciones entre las plantas en los ecosistemas
ha traído consigo el descubrimiento y desarrollo de la alelopatía. Se
ha encontrado que los aleloquímicos juegan un papel importante en el
equilibrio ambiental, pues la presencia de estos compuestos llega a
causar alteraciones en el desarrollo de algunas especies vegetales1,2,3.
Estos metabolitos afectan algunos procesos como la germinación, la
nitrificación o desnitrificación y muchos otros aspectos que pueden
formar parte de los procesos biológicos que se encuentran inmersos en
la actividad agrícola1. Actualmente, como resultado de algunas
investigaciones se pueden conseguir en el mercado productos que por su
naturaleza son biodegradables o que no dañan al ambiente, en
comparación con los pesticidas sintéticos que comúnmente se utilizan
en las actividades agrícolas.
Los compuestos aleloquímicos están presentes en todos los tejidos de
las plantas, su liberación al medio se da como respuesta a algún tipo
de estrés biótico o abiótico4. Existen cuatro vías principales de
liberación de estos compuestos, éstas son: la volatilización,
lixiviación, exudados radiculares y descomposición de residuos. Rizvi
y Rizvi1 mencionan que bajo condiciones naturales, la acción de los
aleloquímicos puede actuar en uno o más de uno de los procesos
fisiológicos de la planta de manera simultánea, afectando la división,
elongación y estructura celular, las fitohormonas, la permeabilidad de
la membrana, la absorción mineral, la apertura estomática, la
fotosíntesis y la respiración, así como la inhibición o estimulación
de enzimas4. La capacidad de poder determinar la forma en que actúan
los compuestos alelopáticos en el metabolismo de la planta dará pauta
para determinar sus posibles usos3. Rizvi y Rizvi1 mencionan la
necesidad de explorar su uso como reguladores del crecimiento,
insecticidas y herbicidas naturales. Con base en lo anterior, el
objetivo de la investigación consistió en evaluar la actividad
fotosintética en cloroplastos aislados de los extractos de Erythrina
americana y la actividad alelopática de Petiveria alliacea y Calia
secundiflora, como posibles especies con actividad herbicida.
2. MATERIALES Y MÉTODOS
Extracción de alcaloides. La muestra en polvo se desgrasó con hexano
El residuo se secó a temperatura ambiente y se extrajo con metanol en
un Soxhlet durante 48.72 h. El disolvente se evaporó a sequedad. El
extracto se disolvió en una solución de H2SO4 al 2 %, después se
realizaron lavados consecutivos con diclorometano. El disolvente libre
de humedad se evaporó para obtener la fracción de alcaloides libres.
El remanente de la fase acuosa se acidificó a pH 2 con HCl
concentrado. La mezcla se llevó a reflujo durante 3 h a una
temperatura entre 60 y 70 ºC. La mezcla fría, se alcalinizó con NaHCO3
hasta obtener pH 8 y se extrajeron con diclorometano, obteniédose los
alcaloides liberados5.
Identificación. Cromatografía en capa fina (CCF). Los análisis
cromatográficos en capa fina se realizaron siguiendo las técnicas
convencionales. Este análisis permitió confirmar de manera preliminar
la presencia de alcaloides en los extractos de E. americana y C.
secundiflora.
Identificación de los alcaloides por Cromatografía de
líquidos/Espectrometría de Masas (CL/EM). Los análisis se realizaron
en fase reversa en un cromatógrafo de líquidos de alta resolución
Waters 600 acoplado a un espectrómetro de masas Finnigan Mat LCQ. En
el cromatógrafo se usó una columna (250 mm X 4.6 mm.) Sum Discovery,
C18. La velocidad de flujo fue de 1 mL/min, y como fase móvil, una
mezcla de acetato de amonio 0.1% (pH 4.7)/ MeOH/ACN (75:20.5; 50:45.5;
50:45.5 correspondientes a los tiempos programados), detector UV 230
nm. Por espectrometría de masas se confirmaron e identificaron los
alcaloides, comparando los espectros con los de muestras auténticas y
con biblioteca de espectros6.
Evaluación de fitotoxicidad. Los tratamientos (extractos: acuoso,
metabólico y de diclorometano) de Petiveria alliacea7 se probaron en
semillas de dos especies de monocotiledóneas: trigo (Triticum aestivum
L) y arroz (Oriza sativa L.), y en dos especies de dicotiledóneas:
como lechuga (Lactuca sativa L.) y amaranto (Amaranthus hypocondriacus
L.). Los extractos acuoso y metanólico de Calia secundoflora8 se
evaluaron en semillas de los cultivos de: Amaranthus hybridus, Lactuca
sativa, en pasto: Lolium perenne, y en dos arvenses: Ipomoea purpurea
y Bidens odorata. Para preparar las diferentes concentraciones del
extracto acuoso, la hoja seca y molida, se maceró durante 24 h a
temperatura ambiente. Los extractos orgánicos se obtuvieron mediante
una maceración material vegetal con metanol por 3 días a temperatura
ambiente. Los extractos crudos resultantes se obtuvieron evaporando el
disolvente a presión reducida. A las semillas utilizadas se les
realizaron pruebas de viabilidad previas al bioensayo. El experimento
de fitotoxicidad se llevó a cabo según el método descrito por Anaya et
al. 5. En cajas de petri de 10 cm de diámetro sobre papel filtro
Wattman No. 1 se adicionaron por separado 2.5 ml de cada solución del
extracto acuoso, se depositaron 50 semillas por tratamiento. Para los
extractos orgánicos, a diferencia del extracto anterior, se
adicionaron 1.5 ml de cada concentración dejándose evaporar antes de
depositar las semillas, y finalmente, se agregaron 2.5 ml de agua
destilada a cada caja. El testigo se preparó de manera similar
utilizando disolvente puro y posteriormente evaporándolo. Los
tratamientos se colocaron en una germinadora bajo condiciones de luz
continua con una intensidad luminosa de 15.39 mol s-1m-2, humedad
relativa de 80 % y a una temperatura de 25 °C. Las variables que se
usaron para evaluar la fitotoxicidad según Chiapusio et al. 10 fueron:
germinación total (Gt; porcentaje de semillas germinadas) y velocidad
de germinación acumulada (VGA; número de semillas germinadas por
tiempo). Las lecturas se realizaron cada 24 horas, la última lectura
se realizó según al ciclo de germinación establecido para cada semilla
de acuerdo a las Reglas Internacionales para el Ensayo de Semillas11.
Se utilizó un diseño experimental completamente al azar con cuatro
repeticiones por tratamiento y una comparación de medias con el método
de Tukey con un α = 0.05. El análisis estadístico se realizó
utilizando el programa SAS12.
Evaluación potenciométrica de la fotofosforilación. Se colectaron
hojas de chícharo (Pisum sativum) cultivadas en condiciones de
invernadero. Los cloroplastos se aislaron de hojas frescas del
cultivo, se prepararon conforme al método descrito por Peña Valdivia13,14.
Se mezcló una alícuota de cloroplastos intactos, equivalente a 30 mg
de clorofila, con 3 mL de medio para síntesis de ATP. Se iluminaron
las muestras con un proyector (fuente luminosa equivalente a 400 mmol
fotones m-2 s-1)y se mantuvieron en agitación a 22 ºC. Se registró
simultáneamente con la iluminación los cambios de pH del medio
(debidos a la fotofosforilación por la H+-ATP sintetasa) con un
microelectrodo combinado de respuesta rápida, conectado a un
potenciómetro de escala expandida. Se realizó el registro del cambio
de pH en función del tiempo con un graficador, conectado a un
potenciómetro. Se apagó la fuente luminosa y se agregó una cantidad
conocida de HCl 0.01N (2-4 mL), para titular el cambio de pH
observado. Posteriormente, se calculó la velocidad de síntesis de ATP.
Medición de la bomba de protones. La medición de la actividad de la
bomba de protones, por el método potenciométrico fue similar al
desarrollado para la síntesis del ATP, con la excepción de que el
medio de reacción no contienen ADP ni Pi. Cada evaluación se realizó
por triplicado. Cada análisis se realizó con las dos fracciones del
extracto metanólico (fracción de alcaloides libres y libertados).
3.RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Efecto de la fracción de alcaloides libres en la síntesis de ATP y en
la bomba de protones. Se observó que al disminuir la concentración de
la fracción de alcaloides se inhibe tanto la actividad de la síntesis
de ATP como el bombeo de H+. Cuando se probaron concentraciones
mayores se observó una recuperación de la actividad al 100 %, respecto
al control. En el caso de la síntesis de ATP, a una concentración del
50 % de la fracción de alcaloides se tiene un efecto similar como
herbicida al reportado, porque se acelera las actividades
fotosintéticas15. La formación de ATP dependiente de luz puede ser
inhibida a través de mecanismos: bloque del transporte de electrones,
inhibición de la reacción de fosforilación y desacoplamiento del
transporte de electrones en la síntesis de ATP16. Al respecto, se
puede decir que el nivel de inhibición de bombeo de H+ y de la
síntesis de ATP es similar a la inhibición del bombeo como una
alteración directa del transporte de electrones probablemente es el
resultado del efecto de la mezcla de alcaloides sobre las actividades
fotoquímicas. Algunos metabolitos secundarios con actividad
alelopática pueden afectar de manera importante las reacciones que
conforman la respiración, la cual es un proceso fisiológico muy
importante en la generación de energía utilizada para el crecimiento
de la planta y sus órganos vegetales17, 18,19.
Efecto de la fracción de alcaloides liberados en la síntesis de ATP y
en la bomba de protones.
Los resultados indican variaciones ligeras, porque no existe un efecto
drástico en el bombeo de H+ por esta fracción. En cambio, el la
síntesis de ATP se observó una activación de mas del 100 % a esas
concentraciones. Resultados similares se han encontrado al probar
dimetilformamida (DMF) como lo señala Peña-Valdivia13, el ATP y el Pi
tienen un efecto protector sobre lo que induce la actividad de la
enzima, considerando que la mayoría de los casos se ha observado un
efecto opuesto.
Evaluación de la fitotoxicidad. El porcentaje de germinación es una
interpretación global de la germinación, no considera el impacto en
los procesos fisiológicos en la germinación, ya que refleja sólo los
resultados finales de la germinación10. Al respecto, al comparar el
efecto fitotóxico de los extractos de Petiveria alliacea sobre el
porcentaje de germinación en las cuatro especies, se señala que el
extracto acuoso resultó ser el menos tóxico para todas. En lo que se
refiere a los extractos orgánicos, el metánólico (Figura 1), fue mas
tóxico para las semillas de lechuga y el extracto de diclorometano lo
fue para amaranto. De los resultados anteriores se puede inferir que
la germinación de las semillas de lechuga fue la que se vio mas
afectada por los tres extractos, siendo posiblemente las mas sensible,
además el extracto de diclorometano afectó selectivamente a las
dicotiledóneas, debido quizás 1) a la presencia de metabolitos de
diferente naturaleza química, 2) a su capacidad de penetración en la
semilla y tejido, 3) a la dispersión y acumulación en los
compartimentos intracelulares, y 4) a la diferente solubilidad de las
fracciones en agua. Por otro lado, aunque se observó muy baja
fitoxicidad del extracto acuoso en comparación con los orgánicos, el
primero tiene menos implicaciones ecológicas, razón por la cual
existen pocos estudios realizados con extractos de naturaleza
orgánica, aunque el estudio de los extractos orgánicos permite
identificar sustancias o metabolitos5,6, en algunos casos con mayor
potencial fitotóxico, y pueden servir de modelo para la síntesis de
nuevos herbicidas naturales.


Figura 1. Efecto del extracto metanólico de P. alliacea en la
germinación de cuatro especies probadas. Tukey (P= 0.05).
En el índice de germinación (IVG) se expresa en porcentaje el número
de semillas germinadas bajo la influencia de un inhibidor. Este índice
a diferencia de la germinación total, nos muestra el progreso que tuvo
la germinación en un lapso de tiempo determinado, por lo que nos
permite analizar más a fondo la influencia que tuvieron los compuestos
alelopáticos en el proceso de germinación. En general, los datos del
IVG obtenidos de los dos extractos de Calia secundiflora para B.
odorata y A .hybridus coinciden con el porcentaje de germinación,
estas dos especies fueron las más afectadas por el extracto
metanólico, en particular el de raíz (Figura 2).
El extracto metanólico resultó ser el más fitotóxico en las cinco
especies probadas, posiblemente la actividad se debió a la presencia
de alcaloides del tipo quinolizidínico, los cuales son solubles en
metanol en mayor grado que en agua. Propiedades fitotóxicas han sido
detectadas en numerosos tipos de alcaloides; pero los mecanismos que
justifican la actividad alelopática aún no han sido estudiados. Sin
embargo, los alcaloides son compuestos con una amplia gama de
actividades como la inhibición de ADN y ARN, de algunas enzimas y la
biosíntesis de proteínas, afectan también la permeabilidad de las
membranas, perturbando su estabilidad20,21. Estos metabolitos afectan
a un amplio espectro de organismos, pero no se descarta su interacción
en los mismos sitios que en las células vegetales. Para entender los
afectos alelopáticos de estos metabolitos, los autores consideran que
el papel de los alcaloides en las interacciones planta-planta pueden
ser una parte de sus funciones como compuestos de defensa en las
interacciones planta-animal.


Figura 2. Efecto de diferentes concentraciones de extracto acuoso y
metanólico de hoja y raíz sobre la velocidad de germinación (Índice de
Velocidad de Germinación) de B. odorata y A. hybridus.
4. CONCLUSIONES
Las fracciones de alcaloides libres y liberados del extracto
metanólico de Erythrina americana afectaron la actividad fotoquímica
de cloroplastos aislados, indicando que las fracciones pueden
presentar alteraciones en la maquinaria fotosintética afectando el
desarrollo de vegetales, es decir, se infiere cierto efecto herbicida.
Los alcaloides identificados fueron del tipo eritrinano. Los extractos
orgánicos de las especies Petiveria alliacea y Calia secundiflora
resultaron más fitotóxicos afectando en mayor grado la germinación de
semillas en las especies probadas. Estos resultados permitirán
identificar nuevas sustancias con actividad herbicida al identificar
los principios activos de los extractos evaluados.
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